Amantadina ELISA Kit For Chicken Pork Duck diagnostica 96 Wells/Kit Sensitivity 0,2 Ppb

Amantadine ELISA Test Kit per Pollo Maiale Anatra 96 ​​pozzetti/Kit Sensibilità 0,2 ppb

 

1. Principio

Questo kit di test si basa sul dosaggio immunoenzimatico competitivo per la rilevazione dell'amantadina.L'antigene di accoppiamento è pre-rivestito sulle strisce dei micropozzetti.L'amantadina nel campione e gli antigeni di accoppiamento pre-rivestiti sulle strisce dei micropozzetti competono per gli anticorpi anti-amantadina.Dopo l'aggiunta del coniugato enzimatico, viene aggiunto il substrato TMB per la colorazione.Il valore della densità ottica (OD) del campione ha una correlazione negativa con l'amantadina nel campione.Questo valore viene confrontato con la curva standard e successivamente si ottengono i residui di amantadina.

 

2. Specifiche tecniche

Sensibilità: 0,2 ppb
Temperatura dell'incubatore: 25 ℃
Tempo di incubazione: 30min～15min

Limite di rilevamento:
Pollo, anatra 0,2 ppb

Tasso di reazione incrociata:
Amantadina 100%

Tasso di recupero:
Pollo, anatra 90±25%

 

3. Componenti

 

1	Strisce di micropozzetti	12 strisce con 8 pozzetti rimovibili ciascuna
2	6× soluzione standard (1 mL ciascuna)	0ppb	0,2ppb
		0,8 ppm	3,2ppb
		12,8 ppm	51.2ppb
3	Coniugato enzimatico	7ml	tappo rosso
4	Soluzione di lavoro anticorpale	7ml	berretto blu
5	Substrato A	7ml	cappello bianco
6	Substrato B	7ml	berretto nero
7	Fermare la soluzione	7ml	tappo giallo
8	Estraente	50ml*2	tappo trasparente
9	Tampone di lavaggio concentrato 20×	15ml	cappello bianco
10	Soluzione ridisciolente concentrata 5×	10ml	cappello bianco

 

4. Materiali richiesti ma non forniti

 

1) Attrezzatura: ELISA Reader (450 nm/630nm), omogeneizzatore, agitatore, centrifuga, bilancia: 0,01 g sensibile alla quantità, dispositivo di essiccazione dell'azoto, incubatore, pipette graduate, stampante

2) Micropipette: monocanale 20 ml ~ 200 ml, 100 ml ~ 1000 ml, multicanale 30 ~ 300 μl

3) Reattivi: acetonitrile, n-esano.

 

5. Pretrattamento del campione

 

Istruzioni (I seguenti punti devono essere trattati prima del pretrattamento)

1) Per gli esperimenti possono essere utilizzati solo i puntali monouso e i puntali devono essere cambiati quando vengono utilizzati per assorbire reagenti diversi;

2) Prima dell'esperimento, ogni utensile sperimentale deve essere pulito e dovrebbe essere ripulito se necessario, al fine di evitare la contaminazione che interferisce con i risultati sperimentali.

 

Preparazione della soluzione prima del pretrattamento del campione:

1) Soluzione di estrazione del campione

6 parti di acetonitrile + 1 parte di estrattore per ottenere la soluzione di estrazione del campione pronta all'uso.

2) Soluzione di dissoluzione del campione

Utilizzare 1 parte di soluzione di ridissoluzione concentrata (5X) e sciogliere con 4 parti di acqua deionizzata per ottenere la soluzione di ridissoluzione del campione pronta all'uso.

Preparazione dei campioni

 

5.1 Preparazione del campione di pollo, anatra

1) Prelevare 3,0 ± 0,05 g di campione di tessuto omogeneizzato in una provetta da centrifuga da 50 ml;aggiungere 6 ml di soluzione di estratto campione, agitare per 3 minuti, centrifugare a oltre 4000 giri/min a temperatura ambiente (20 - 25 ℃) per 5 minuti;

2) Prendere 2 ml di fase organica limpida in un contenitore asciutto, asciugare con azoto o aria a 50~60 ℃;

3) Aggiungere prima 1 ml di n-esano, quindi aggiungere 0,5 ml di soluzione di ridissoluzione del campione, miscelare per 30 secondi, centrifugare a una velocità superiore a 4000 giri/min a temperatura ambiente (20 - 25 ℃) per 5 minuti, eliminare lo strato superiore di n-esano;

4) Prendere 50 μl di liquido a strato inferiore per testare

Fattore di diluizione: 0,5

 

6. Procedure ELISA

 

6.1 Istruzioni

1. Portare i reagenti ELISA a temperatura ambiente (20 - 25 °C) prima dell'uso.

2. Riportare i reagenti ELISA a 2-8 ℃ subito dopo l'uso

3. La riproducibilità ELISA nel processo di analisi dipende in gran parte dalla consistenza della piastra di lavaggio, il corretto funzionamento della piastra di lavaggio è il punto di determinazione del programma ELISA

4. In tutti i processi di incubazione a temperatura costante, evitare l'esposizione alla luce, sigillare la micropiastra con la membrana di copertura

 

6. 2 Procedure operative

1. Portare il kit di test a temperatura ambiente (20-25 ℃) per almeno 30 minuti, notare che ogni reagente deve essere agitato uniformemente prima dell'uso;

2. Inserire le strisce di micropozzetti richieste nei telai delle piastre.Risigillare la micropiastra inutilizzata, conservata a 2-8 ℃, non congelata.

3. Preparazione della soluzione: diluire il tampone di lavaggio concentrato 20× da 15 ml con acqua deionizzata fino a 300 ml.

4. Numerazione: numerare i micropozzetti in base ai campioni e alla soluzione standard;ogni campione e soluzione standard deve essere eseguito in duplicato;registrare le loro posizioni.

5. Aggiunta standard/campione: aggiungere 50 µl di campione o soluzione standard in pozzetti duplicati separati, quindi aggiungere coniugato enzimatico, 50 µl/pozzetto;quindi soluzione di lavoro dell'anticorpo, 50 µ l/pozzetto.Miscelare delicatamente agitando manualmente la piastra, sigillare la micropiastra con la membrana di copertura, incubare a 25 °C per 30 min al buio.

6. Lavare la micropiastra: aprire con cautela la membrana del coperchio, versare il liquido dal micropozzetto;aggiungere 250 µ l/pozzetto di tampone di lavaggio diluito, lavare completamente per 4-5 volte, 15-30 s ogni volta, quindi estrarre e sbattere per asciugare con carta assorbente. (Usare la lancia inutilizzata per perforare la bolla dopo l'asciugatura)

7. Colorazione: aggiungere 50 µL di soluzione di substrato A, quindi 50 µL di soluzione B in ciascun pozzetto.Miscelare delicatamente agitando manualmente la piastra e incubare a 25 °C per 15 minuti al buio per la colorazione.

8. Determinazione: aggiungere 50 µL della soluzione di arresto in ciascun pozzetto.Mescolare delicatamente agitando manualmente la piastra.Impostare la lunghezza d'onda del lettore di micropiastre a 450 nm per determinare il valore OD di ogni pozzetto.(Si consiglia di leggere il valore OD alla doppia lunghezza d'onda 450/630nm entro 5 min).

 

7. Giudizio sul risultato

Esistono due metodi per giudicare i risultati;il primo è il giudizio approssimativo, mentre il secondo è la determinazione quantitativa.Si noti che il valore OD del campione ha una correlazione negativa con l'amantadina nel campione

7.1 Determinazione qualitativa
L'intervallo di concentrazione (ng/ml) può essere ottenuto confrontando il valore medio di assorbanza con gli standard.Supponiamo che il valore di assorbanza del campione uno sia 0,3, il campione due sia 1,0 e gli standard siano: 0 ppb di 2,243;0,2ppb di 2,054;0,8ppb di 1,715;3,2ppb di 1,074;12,8ppb di 0,451;51,2ppb di 0,155.Quindi la concentrazione del campione è nell'intervallo di 12,8 ppb ~ 51,2 ppb;Il secondo campione è 3,2 ppb ~ 12,8 ppb.L'intervallo di concentrazione dell'amantadina nei campioni può essere ottenuto moltiplicando per la corrispondente diluizione del campione.
 

7. 2 Analisi quantitativa
Per calcolare la concentrazione dei campioni, è necessario creare una curva standard.Prima di creare la curva standard, è necessario conoscere il concetto di % di assorbanza.
Calcolo dell'assorbanza %:

 

Percentuale del valore di assorbanza =	B	×100%
	B0

 

B: il valore medio di DO del campione o della soluzione standard
B0: il valore medio di DO della soluzione standard da 0 ng/mL
Lo standard zero è quindi reso uguale al 100 % ei valori di assorbanza sono indicati in percentuale.I valori calcolati per gli standard sono inseriti in un sistema di coordinate su carta millimetrata semilogaritmica rispetto alla concentrazione di amantadina [ng/mL].La concentrazione di amantadina in ng/mL (ppb) corrispondente all'assorbanza di ciascun campione può essere letta dalla curva di calibrazione.
Un software speciale per l'analisi dei risultati di ELISA faciliterà le determinazioni doppie o multiple.Se hai bisogno, chiama per richiedere.

 

8. Precauzioni

 

1. Il valore OD standard sarà basso se la temperatura ambiente è inferiore a 25 ℃ o la temperatura del reagente e il campione non è tornato a temperatura ambiente (20-25 ℃).
2. La micropiastra viene asciugata durante il processo di lavaggio, che sarà accompagnato da non linearità della curva standard e scarsa riproducibilità;quindi, procedere alla fase successiva subito dopo il lavaggio.
3. Mescolare bene prima di aggiungere qualsiasi reagente.
4. La soluzione di arresto è una soluzione di acido solforico 2M, evitare il contatto con la pelle.
5. Non utilizzare il kit oltre la data di scadenza.L'uso di reagenti diluiti o adulterati del kit può causare variazioni della sensibilità e dei valori di rilevamento OD.Non sostituire i reagenti in diversi lotti di kit.
6. Conservazione: Conservare a 2-8°C, non congelare.Richiudere le micropiastre non utilizzate in sacchetti autosigillanti.I materiali standard e gli accoppiatori incolori sono sensibili alla luce e non possono essere esposti direttamente alla luce.
7. Eliminare qualsiasi soluzione colorante il cui colore indica che la soluzione si è degradata.Il valore di rilevamento (450/630nm) della soluzione standard 0 (0 ppb) è inferiore a 0,5 ((A450nm<0,5)) indicando la sua denaturazione.
8. La temperatura di reazione ottimale è di 25 ℃.Se la temperatura è troppo alta o troppo bassa, la sensibilità di rilevamento e il valore OD cambieranno.

 

9. Data di conservazione e scadenza

Conservazione: conservare a 2-8 ℃, non congelato.
Data di scadenza: 12 mesi;la data di produzione è sulla scatola.
Nota: se la confezione sottovuoto della micropiastra presenta perdite, è ancora valida per l'uso, non influisce sul risultato del test, rilassati per l'uso.

 

 

 

 

 

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